Aucun titre de diapositive - Djamiatic

Aucun titre de diapositive - Djamiatic

DROULEMENT DE LA PRODUCTION DES HYBRIDOMES SELECTION DES HYBRIDOMES TEST DES HYBRIDOMES FUSION DES CELLULES ISOLEMENT DES HYBRIDOMES OBTENTION DES CELLULES PRODUCTION DES

HYBRIDOMES O B T E N T I O N D E S C E L L U L E

+ IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC LANTIGNE TUDI OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES HGPRTOBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES FUSION F U S I O N D E

S C E L L U L E S + Par mthode chimique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly thylne glycol) Par mthode physique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION SELECTION

S E L E C T I O N D E S + Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptrine Thymidine Cellule mylomateuse HGPRT- H

Y B R I D O M MORT CELLULAIRE E Impossibilit de se diviser S HYBRIDOME SELECTIONNE ISOLEMENT Lymphocyte B MORT CELLULAIRE disparition aprs quelques divisions

I S O L E M E N T D E S H Y B R I D O M E

+ Ds que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps dsir (transferts des puits de 0,3 2 ml, puis des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux mthodes sont utilises pour obtenir un clone partir d'une cellule : Sur milieu glos Une colonie = une cellule initiale TEST Par dilution limite Une ou zro cellules par puit T E S T

+ D E S H Y B R I D O M E S PRODUCTION TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA

DU TYPE DANTICORPS PRODUIT PAR DES METHODES DIMMUNOPRECIPITATION P R O D U C T I O N + Amplification des hybridomes OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX

D E S A C M Production par cultures cellulaires Production dans les liquides d'ascites CONSERVATION DES HYBRIDOMES AMP HGPRT Hypoxanthine IMP

GMP Azasrine Aminoptrine Synthse endogne Aminoptrine Thymidine Thymidine Kinase TMP Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptrine, thymidine Milieu Haza : Hypoxanthine, azasrine L'obtention d'anticorps purs en quantit suffisante (milligrammes) permet : - de caractriser les antignes tudis et de mettre au point des dosages radioimmunologiques ; - le couplage d'anticorps monoclonaux sur Sepharose.

- le couplage des anticorps monoclonaux sur plastique. Des sparations et purifications cellulaires (mthode dite de paning ) ont ainsi te ralises, comme par exemple la sparation des lymphocytes B et T humains ou celle de certaines populations cellulaires drivant de la moelle. La production d'anticorps contre des antignes de diffrenciation cellulaire ou contre des antignes prsents sur de faibles fractions de populations cellulaires. C'est par exemple le cas des marqueurs de souspopulations de lymphocytes T ou de cellules nerveuses. LES CELLULES DE MYELOME Les cellules de mylome, les plus couramment utilises, sont celles de la souche de souris Balb/c. Cultiver les cellules murines dans un milieu MEM Dulbecco contenant 10-20 % de srum de veau et 4,5 g/l de glucose. Incuber les cellules 37C dans une atmosphre enrichie en C02 (5-10 %), avec une inoculation de 5.10 4 cellules/ml. Maintenir les cellules en culture des densits de 5.10 4 1.10 6 cellules/ml. Pour la fusion, les cellules de mylome doivent tre en phase logarithmique et le taux de cellules vivantes doit tre suprieur 98 %. Sur des lignes mises en culture depuis au moins une semaine, dterminer le taux de survie par un test de viabilit au bleu trypan. Contrler la mutation HGRT par addition de 20 g/m d'azaguanine.

LES LYMPHOCYTES : IMMUNISATION DE LANIMAL Habituellement, on utilise la mme ligne d'animaux que celle employe pour l'obtention des cellules mylomes. La souche de souris Balb/c est donc approprie, d'autant plus qu'elle se rvle excellente pour la production ultrieure in vivo des hybridomes. Mlanger l'antigne choisi en mulsion avec un adjuvant qui stimule le systme immunitaire. L'adjuvant de Freund peut par exemple tre utilis : il s'agit d'une suspension de mycobactries inactives. Linjecter sous la peau ou dans la cavit pritonale de l'animal. La plus grande attention doit tre apporte, afin que l'exprimentateur ne s'injecte pas l adjuvant, ce qui provoquerait des complications immunitaires longues (arthrite). Rpter plusieurs fois ce processus un intervalle de 3-4 semaines ; ainsi les lymphocytes B qui ragissent l'antigne choisi sont chaque fois plus fortement stimuls. La dernire injection se fait par voie intraveineuse. Cette introduction dans le sang d'une forte dose d'antigne induit une prolifration intense des cellules stimules, aprs environ 3 jours. ISOLEMENT DES LYMPHOCYTES Aprs 3 jours tuer l'animal et extraire sa rate sous condition strile. Broyer ensuite cet organe et mettre les cellules en suspension dans un milieu dpourvu de srum.

Ces cellules sont transfres dans un tube centrifugation contenant 3 ml de lymphoprep. Les lymphocytes sont spars des globules rouges et du liquide de la rate par centrifugation sur gradient de densit. Centrifuger 400 g pendant 30 minutes. Rcuprer les lymphocytes l'interface et les laver avec du PBS (centrifugation 10 minutes 100 g). Reprendre le culot cellulaire avec 2 ml de PBS. Homogniser doucement avec une pipette. Quand la suspension est homogne raliser un test de viabilit au bleu Trypan suivi d'un comptage l'hmatimtre On obtient 1.107 1.10 8 cellules par rate de souris. Le taux de survie est dtermin par coloration au bleu trypan ou par fluorescence. FUSION AVEC PEG Ces lymphocytes servent directement la fusion avec les cellules mylomes, en phase exponentielle. Laver les cellules du mylome dans un tampon car la fusion s'opre difficilement en prsence de protines sriques Prparer les suspensions cellulaires pour avoir une proportion de 5 1. Les mlanger. Rajouter 1 ml de PEG concentr 50 % dans 40 ml de mlange cellulaire. Le traitement de fusion ne doit pas durer longtemps (au maximum quelques minutes), car le PEG est cytotoxique. Quant le PEG est ajout aux cellules et

dlicatement mlang, des agrgats cellulaires se forment, ce qui indique que les membranes cellulaires sont en voie de fusion. Eliminer le PEG par centrifugation et laver les cellules. Ces dernires sont dilues avec des milieux de culture et distribues raison de 1 ml dans chaque puits de plaques de microtitration. ELECTROFUSION La fusion des cellules, l'aide d'un champ lectrique, ncessite un appareillage assez coteux, mais offre l'avantage d'une augmentation la fois des taux de fusion (1:10 au lieu de 1 : 104) et du nombre de cellules hybrides stables. Une majorit des hybrides provient de la fusion de deux cellules et non de plusieurs, comme c'est le cas avec le PEG. Le processus de fusion peut tre observ au microscope. Ce procd se ralise en deux tapes. Mettre les cellules fusionner en suspension dans un milieu faible conductibilit. Celui ci est obtenu par mise dans un champ lectrique alternatif d'une amplitude de 250 V/cm et une frquence de 1,5 MHz. Les cellules, en migrant dans ce champ lectrique, forment des chanettes de plusieurs cellules en tablissant le contact membranaire entre les cellules fusionner. Faire subir un choc lectrique de forte intensit (3.5 KV/cm) pendant trois fois 15 s. On provoque ainsi des perforations rversibles des membranes cellulaires dans les zones de contact ce qui entrane la fusion des cellules.

SLECTION DES HYBRIDOMES Les cellules obtenues aprs traitement fusogne sont mises en suspension dans un milieu de croissance et cultives dans des puits. Le premier travail va tre de slectionner les seules cellules hybrides. Aprs 24 heures, ajouter une solution de HAT (hypoxanthine, aminoptrine, thymidine) dans le milieu de croissance. Dans ce milieu slectif, seuls les hybrides lymphocytes (HGPRT+) / cellules mylomes (HGPRT-) survivent, grce l'hypoxanthine et la thymidine fournies par le milieu HAT. Aprs deux semaines, liminer progressivement le milieu HAT. On considre que les seules cellules encore capables de se multiplier ont stabilis leur rsistance au HAT et sont obligatoirement des hybrides. On permet alors aux hybrides d'utiliser de nouveau la voie endogne de synthse des nuclotides. SLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS Le second travail de slection consistera dtecter les hybrides scrtant des anticorps spcificit dfinie. Ces tests doivent tre sensibles (environ 10 -8 g d'anticorps/ml), reproductibles et ralisables rapidement en grand nombre. Il faut viter la saturation des puits de culture ou leur envahissement par des hybrides non scrteurs.

Mettre l'antigne en solution dans un tampon et le distribuer dans des microtitration en chlorure de polyvinyle. Les protines adhrent de spcifique au chlorure de polyvinyle (PVC). Si une molcule porteuse a pour l'immunisation, il faut en utiliser une diffrente pour coupler le changer d'agent couplant. plaques de faon non t utilise peptide et Bloquer les autres sites libres la surface du plastique par addition d'albumine ou d'autres protines ajoutes en concentration saturante. Ajouter dans ces puits un aliquot des surnageants des cultures d'hybridomes contenant les anticorps. Incuber environ 60 minutes pour permettre l'anticorps de se fixer l'antigne immobilis. Laver les puits avec un tampon. SLECTION DES HYBRIDOMES PRODUCTEURS De nombreux procds sont maintenant utilisables : test radioimmunologique (RIA), rvlations immunoenzymatiques (ELISA), immunofluorescence, cytotoxicit, immunocytologie, etc. ....

Ajouter le ractif rvlateur. Ce ractif est soit un anticorps antimurin (produit par une espce diffrente de l espce souris) soit la protine A bactrienne qui a une excellente affinit pour de nombreuses immunoglobulines. Ces molcules sont marques par un radioisotope, un fluorochrome ou une enzyme. Suivant le type de rvlateur effectuer la lecture des puits l il nu ou avec un appareil de mesure ( compteur scintillation ou spectrofluorimtre). Le couplage se fait le plus souvent avec de l'iode marque (I 126), avec un compos chimiluminescent (drivs du luminol) ou avec une enzyme telle que la peroxydase, la phosphatase alcaline ou la -galactosidase. Cette dernire mthode est galactosidase. Cette dernire mthode est dnomme ELISA (enzyme-galactosidase. Cette dernire mthode est linked-galactosidase. Cette dernire mthode est immunoabsorbent-galactosidase. Cette dernire mthode est assay). CLONAGE EN MILIEU GLOS Le clonage des cellules s effectue en milieu semi-solide prpar avec une glose se solidifiant 32C. Les colonies formes sont transfres en milieu liquide dans des puits. Le milieu se prsente sous forme de deux couches de bacto-agar de 0.5% et 0.3% autoclav et coul dans des boites de culture de 5 cm de diamtre. Lagar aura t prpar avec du milieu HAT. Couler la premire couche dagar 0.5% dans la boite de culture en diluant une solution stock 5% avec le milieu HAT ( 5 ml par boite). Prparer des aliquots de 5 ml dagar 0.3% et les laisser en surfusion 44 C. Juste avant de couler la couche suprieure, rajouter 10 l des hybridomes 3.10 5

cellules/ml. Prparer trois boites de chaque dilution. Transfrer les boites dans l incubateur CO 2 (5%) en s assurant que latmosphre est suffisamment humide. Laisser 10 14 jours dans l incubateur. Au bout de 14 jours, transfrer les colonies apparues dans des plaques de microtitration et les tester pour l activit anticorps. CLONAGE PAR DILUTION LIMITE A une dilution suffisante, on estime que les cultures proviennent d'une seule cellule. Pour plus de scurit, le procd de clonage par dilution est rpt. A une moyenne de 0,5 cellule par puits, on estime que 30 % des puits ne contiennent qu'une seule cellule. Cette mthode est une procdure en trois temps. La premire srie de dilutions permet de slectionner les cellules qui scrtent de haut niveaux d anticorps. Effectuer des sries de dilutions pour obtenir 5.102 cellules/ml et mettre en culture en milieu liquide HAT dans des puits de 0,3 ml. Laisser en incubateur 7 jours La deuxime srie de dilutions permet de slectionner les lignes cellulaires partir dune seule cellule. Elle ncessite la prsence supplmentaire d une couche de cellules de rate. Effectuer des sries de dilutions pour obtenir 1 cellule pour un puits ou deux puits. Mettre en culture en milieu liquide HAT. Laisser en incubateur 10-14 jours en changeant le milieu rgulirement.

La troisime srie de dilutions permet de vrifier le clonage. CONSERVATION Aux divers stades de la slection, les hybridomes choisis sont congels. On pallie ainsi toute contamination ou accident ultrieur et on a en phase finale du matriel d'inoculation pour la production. centrifuger un volume de suspension cellulaire contenant 10 7 cellules. Enlever le surnageant et mlanger avec le milieu de conglation prpar pralablement (0.9 ml de SVF et 0.1 ml de DMSO plac dans la glace) Transvaser dans un tube conglation renseign. Le placer -20 C pendant environ 30 minutes. Le transfrer alors -80C pendant 1 journe. Le transfrer et le conserver sous azote liquide. PRODUCTION DES ANTICORPS PAR REALISATION D ASCITE Pour la production in vivo, une ascite (panchement pritonal) est cre. Raliser deux injections de 0,5 ml de pristane une semaine d'intervalle chez une souris de ligne dfinie dont le fonctionnement du systme immunitaire a t inhib par une injection de ttramthylpentadcane . Une semaine plus tard, injecter dans la cavit pritonale de la souris environ 10 7 hybridomes dans un milieu sans srum.

Aprs une deux semaines, recueillir par ponction de la cavit pritonale 2 5 ml de liquide contenant 2 10 mg/ml d'anticorps, soit au maximum 50 mg par animal. La culture en ascite permet une production flexible de petites quantits d'anticorps monoclonaux (au maximum de l'ordre du gramme). Cette production in vivo prsente cependant plusieurs inconvnients notamment la petite taille de la souris, la prsence de nombreuses enzymes protolytiques dans l'ascite. De plus le liquide de l ascite contient un mlange de protines dont certaines sont des immunoglobulines. I1 se pose aussi le problme thique de l'utilisation des animaux et de l'injection de cellules cancreuses. La production in vivo devient de plus en plus une technique obsolte. PRODUCTION EN BIOREACTEUR Pour diverses applications, il est ncessaire de produire des quantits plus importantes d anticorps. Pour l'imagerie in vivo, on doit disposer de quelques centaines de microgrammes d'anticorps par patient, soit plusieurs grammes pour 10 000 patients. Pour la thrapie in vivo plusieurs centaines de milligrammes sont requises par patient, soit plusieurs kilogrammes pour le traitement de 10 000 patients. Les premires cultures s'effectuent dans des rcipients fond plat, les deuximes se font dans des bouteilles cylindriques mises incuber sur un agitateur rotation lente et rgulire. La production a plus grande chelle peut s'effectuer soit en suspensions homognes (racteurs agitation mcanique ou racteurs "air lift" agitation par circulation d'air), soit avec des cellules immobilises (fibres creuses, microcapsules,

cartouches de cramique). La capacit des bioracteurs actuellement utiliss se situe entre 10 et 10 000 litres. Les quantits d'anticorps produits sont fonction du type de cellule, du milieu et des conditions environnementales. La productivit se situe habituellement pour les anticorps murins entre 30 et 300 g/ml. PRODUCTION EN BIOREACTEUR Les rsultats en systme "air lift" sont meilleurs que ceux observs dans les flacons agits (multiplication par un facteur de 2,5). Dans certains cas une augmentation considrable de la productivit spcifique (2 5 fois) est obtenue par des cultures ralises avec des cellules en perfusion qui sont maintenues en phase stationnaire. Un cycle de production dure typiquement 6 16 jours. Pour une telle production, il est recommand dutiliser des milieux dfinis et non des milieux base de srum contenant un mlange complexe de protines. On rduit ainsi les cots de production et de purification. De plus, cela permet d'liminer le risque de contaminations accidentelles par des virus ou des micro-organismes ventuellement prsents dans le srum. L'optimisation et la rgulation de la production sont plus facile avec un milieu de composition dfinie (par exemple le milieu eRDF). Ces milieux contiennent encore souvent des hormones et des facteurs de croissances (prolactine, corticotropine, insuline, transferrine, testostrone et acide linolique) .

EXTRACTION ET PURIFICATION DES ANTICORPS PRODUITS La premire tape consiste liminer les cellules. Cela est ralis facilement grande chelle par centrifugation continue. L'ultrafiltration flux tangentiel permet ensuite d'obtenir un concentr contenant habituellement 1 5 g d'anticorps par litre. Les techniques de purification dpendent des caractristiques de l'anticorps et de l'usage que l'on peut en faire. Ces mthodes sont principalement les suivantes : - prcipitation dans une solution de sulfate d'ammonium gnralement 50 %; - chromatographie par change d'ions (DEAE par exemple); - chromatographie par filtration sur gel ; - chromatographie par affinit avec la protine A du staphylocoque ou avec des anticorps anti-immunoglobulines fixs de la spharose active. Les anticorps sont ensuite lus par des gradients de pH ou de force ionique. I1 est ncessaire d'utiliser des techniques peu agressives car les anticorps sont fragiles et facilement dnaturs. Pour des anticorps utiliser in vivo, un degr de puret lev est requis. L'obstacle majeur tient non pas aux techniques de purification mais la sensibilit des mthodes de dosage des impurets.

Recently Viewed Presentations

  • Triangles 6A C2: Trigonometry KUS objectives BAT review

    Triangles 6A C2: Trigonometry KUS objectives BAT review

    review the sine, cosine and area rules. BAT understand the ambiguous case with the sin rule . Starter: Note: make sure your calculator is in degree mode. a). b). c). x. 8cm. 55° 27° 14mm. z. y° 7m. 5m
  • Tennessee - SABE USA

    Tennessee - SABE USA

    People First of Tennessee exhibit booth - recruited 30 new members (April & Lorri) Bill, Sam, April, Lorri & allies attended . ... Article by April Meredith about the subminimum wage issue, the Time Act, and PFT/NFB advocacy collaboration.
  • Titles - The Library of Congress

    Titles - The Library of Congress

    The second example is an episode from the television program The Simpsons. Note that the instructions distinguish between part titles and part designations. Designations are defined as "a general term, with or without a numeric or alphabetic designation." The instructions...
  • AWK Utility - Computer Science at NIU

    AWK Utility - Computer Science at NIU

    Unit Overview. Transport layer. User datagram protocol. UDP programming. Example UDP client/server programs. CSCI 330 - UNIX and Newtork Programming
  • ESO 208A: Computational Methods in Engineering Lecture 1

    ESO 208A: Computational Methods in Engineering Lecture 1

    Thomas Algorithm (for tri-diagonal banded matrix) LU-Decomposition: A general method. Ax = b. In most engineering problems, the matrix . A. remains constant while the vector . b. changes with time. The matrix . A. describes the system and the...
  • The Roman Republic Crumbles  The Roman Republic began

    The Roman Republic Crumbles The Roman Republic began

    Caesar took the army and crushed Pompey "Veni, Vidi, Vici"--- "I came, I saw, I conquered". Pompey Julius Caesar Julius Caesar Takes Power Caesar passed new reforms in Rome. He also became romantically involved with Queen Cleopatra of Egypt. A...
  • PowerPoint 演示文稿 - GitHub Pages

    PowerPoint 演示文稿 - GitHub Pages

    We need a way to skip all overlapped depth. Compact Tree Based Framework. ... Nodes in compact tree remain their relative orders in trie. Use depth information stored in the compact node to skip overlapped nodes. 1. 2. 12. 6....
  • Chapter 7: Access Control Lists

    Chapter 7: Access Control Lists

    Integrated Services Digital Network (ISDN) is a circuit-switching technology that enables the local loop of a PSTN to carry digital signals, resulting in higher capacity switched connections. ISDN changes the internal connections of the PSTN from carrying analog signals to...